游离脂肪酸微量测定试剂盒
W1001-100次
描述：游离脂肪酸(free fatty acids, FFA)通常指血液中10碳以上的非酯化(non-esterified)脂肪酸。正常血清中18碳的油酸占54%，16碳的软脂酸占34%，18碳的硬脂酸6%，另外还有少量12碳的月桂酸、14碳的肉豆蔻酸和20碳的花生四烯酸。血中FFA与白蛋白结合形成简单的脂蛋白。其主要来源为，从消化道吸收入血；脂蛋白脂酶水解脂蛋白复合物中的甘油三酯；脂肪细胞内的脂肪酶水解细胞内甘油三酯。FFA浓度与能量代谢如脂代谢和糖代谢以及内分泌状态密切相关。血中FFA浓度增加是饥饿、运动的生理反应，也参与肥胖、高脂血症、动脉粥样硬化、糖尿病胰岛素抵抗等代谢综合征病理进程。游离脂肪酸是临床和基础研究中常用的检测指标。
试剂盒采用改良比色法测定血清或血浆游离脂肪酸浓度。游离脂肪酸经有机抽提和铜皂化，进行显色反应，用721分光光度计测定550nm光密度进行比色定量。经典方法需要较大量的(0.2ml)血清样品，灵敏度低重复性差，铜试剂不稳定每次须新鲜配制。本试剂盒采用改良的铜试剂，稳定性佳；同时采用高敏显色剂，灵敏度高，可检测少至10 μl血清中的游离脂肪酸；重复性好，测定结果可靠，完全可与酶法媲美。另外，用1.5~2 ml微量离心管和微型低速离心机进行操作，20分钟完成，操作更为简捷。
适用：人和动物血清、血浆游离脂肪酸测定。检测最低值约为0.1 mmol/L。
组成(100 assay):
铜试剂Cu Reagent: 25 ml, 4 ºC稳定6个月。
显色剂Color reagent：50 ml,－20 ºC密封保存，短期4 ºC in dark。
标准品Standard: Palmitic acid, solid, ~500 mg。－20 ºC长期保存，4 ºC稳定6个月。
自备试剂：分析纯氯仿chloroform，正庚烷n-heptane，甲醇methanol，建议使用色谱纯的氯仿和甲醇。
所需器材
721分光光度计；1-cm光径玻璃比色杯，容积为1 ml或2 ml，切记不能用酶标板或普通一次性塑料比色杯测定。可使用1.5~2 ml聚乙烯离心管如Axygen进口，或较大的带聚乙烯(polyethylene)盖子的玻璃试管或进口聚乙烯试管。不同来源的国产离心管材料，可能会导致批间和批内测量结果波动。
实验准备
1. 反应对铜离子极其敏感。使用的管子和吸头，避免由铜试剂污染导致测定失败。接触过铜试剂的试管重复使用时应泡酸或浸泡在去垢剂中过夜，然后用大量清水冲洗，最后用蒸馏水清洗2遍。
2. 配制抽提剂：用户自备氯仿chloroform、正庚烷n-heptane、甲醇methanol。按照体积比例(氯仿：正庚烷：甲醇= 56 : 42 : 2)配制抽提剂200 ml。贴上“抽提剂”标签，密封，短期室温长期4 ºC储存。
3. 配制标准品：精确称取16.4 mg标准品(Palmitic acid，分子量=256.44)，溶于自配的抽提剂中，终体积1ml，终浓度64 mM。－20ºC保存。制备标准曲线时用抽提剂将64 mM标准品稀释为3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1 mM，每管体积可为1 ml，现用现配，用毕弃去。
测定方案
1. 参见表1加样。取2 ml或1.5 ml聚乙烯离心管。加入20 μl (10~50 μl)血清/血浆、标准品、空白对照液体。用等体积H2O或生理盐水做空白对照。
2. 向管中加1.5 ml抽提剂，盖紧盖子，悬涡混合器振荡30秒。
3. 然后加0.3 ml铜试剂Cu Reagent，溶液分为两相，悬涡混合器振荡60秒。各管混匀强度时间须一致。
4. 将离心管平放在旋转摇床上，快速摇晃20分钟。也可室温放置20分钟，期间振荡3次，每次30秒。
5. 5000 rpm室温离心5分钟。各管应采用一致的离心速度和时间。
6. 取1ml上层相转移到新管。吸头勿碰管壁或下层相液体，否则应重新离心取液。
7. 向新管内加0.5 ml显色试剂Color reagent。混匀，室温孵育5分钟。
8. 将管中液体转移到1-cm光径玻璃比色杯，读取550 nm (530-570 nm) OD值。OD值在2小时内稳定。
做标准曲线，计算FFA浓度。Excel作图步骤：各标准管OD值为y轴，标准品浓度为x轴。(1)鼠标左键圈住数据，点击-做图向导-，选择-散点图-，点击-完成-。(2)鼠标右键点图上的某一点，点击-添加趋势线-，点击-选项-，点击-显示公式-和-R2值-。
注意事项
1. 线性范围检测最低值约为0.1 mmol/L。在一定范围内加大样品量可增加检测范围的低限。人FFA参考值为0.2~0.6 mmol/L，mouse/rat FFA约为0.20~0.45 mmol/L。进食后FFA浓度降低，禁食后FFA浓度升高。测定组织细胞培养液中更低浓度的FFA，应选择超灵敏的“游离脂肪酸超敏测定试剂盒#E1001”，其灵敏度25-2000 μmol/L。
2. 血中的甘油三酯可通过酶或非酶水解导致FFA测量值升高。血清4 ºC储存24小时FFA升高~20%，即使－20 ºC冻存的血清FFA仍然升高，见下图。因此血液标本应尽快并且同批次测定，否则应短暂－20 ºC冻存。样品的不恰当储存是导致批间和批内差异的主要原因。
3. 血清或血浆均可用于测定。标准管、测试管、空白对照管采用一致的抽提振荡混匀、离心、显色反应条件，对减少测定值的波动很关键。
4. 读取OD值时先用水做空白调零，然后测定样品空白对照。
5. 不推荐使用1.5-ml离心管。但如没有2-ml离心管可采用Axygen进口1.5-ml聚乙烯(polyethylene)离心管，按比例加样，参照下表1。使用1.5-ml离心管时管内将充满液体，会明显影响振荡、取样，影响测定值的重复性及平行性。
6. 加铜试剂离心后如果上层有铜滴飘浮，取出离心管手指轻弹或在桌面轻轻磕几下，使之下沉，然后重新离心。
表1：1.5-ml与2-ml离心管加样量
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1.5-ml tube |
2-ml tube |
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加入标准或待测样品 |
0.01-0.05 |
0.01-0.05 |
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加入抽提试剂 |
1.2 ml |
1.5 ml |
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加入铜试剂 |
0.2 ml |
0.3 ml |
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取上层相转移到新管 |
0.8-1.0 ml |
1.0-1.2 ml |
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加显色试剂 |
0.5 ml |
0.5 ml |
Right Figure. Effect of storage at - 15°C on the FFA content of a plasma pool from fed rats.
Determinations were made in triplicate on an individual sample that was thawed only once.
