组织甘油三酯酶法测定试剂盒
W1003-2-250次
描述：甘油三酯由甘油与脂肪酸酯化而成，是血脂的主要成分，也是机体重要的供能物质。高甘油三酯是临床常见的高脂血症，与多种疾病有关。除了血浆甘油三酯外，组织、细胞中的甘油三酯聚集增加，也与肥胖、脂肪肝、胰岛素抵抗、能量代谢异常等诸多病理过程密切相关。
与血浆甘油三酯测定相比，实体组织和细胞的甘油三酯测定并非易事。试剂盒避免了有毒的氯仿甲醇提取、繁杂的氮气吹干和脂质复溶等步骤，采用高效能试剂进行裂解和甘油三酯抽提，以及优化的GPO Trinder酶学反应组分和操作步骤。简单易行，灵敏度高，线性范围20~2000 μmol/L。适用于生物、医学、农业、畜牧业、食品材料，用于精确测量动物和植物的组织、细胞、以及固态食品材料、含高浓度油料样品中的甘油三酯。
适于测定样品
(1) 动物实体组织
(2) 培养细胞
(3) 油料植物组织和种子、固态食品材料
(4) 液态成品油或含高浓度油样品
(5) 血浆甘油三酯测定请使用W1003-2
测定原理：根据经典GPO Trinder反应，脂肪酶分解血甘油三酯为甘油。甘油激酶催化甘油生成3-磷酸甘油，后者被磷酸甘油氧化酶氧化生成过氧化氢，在过氧化物酶催化下生色底物转化为苯醌亚胺，光密度值与甘油三酯浓度成正比。
组成 (105次微板测定或30次1 ml比色杯测定)
(1)
裂解液 100 ml
(2)
R1试剂 16 ml
(3)
R2试剂 4 ml
(4)
4 mM甘油标准品1 ml
4 ºC避光储存3月。
所需设备
721、722型可见光分光光度计、酶标仪、生化分析仪。96孔微板或比色杯光径1cm。最佳工作波长550nm，如无此波长建议优先选用570nm、次选530、490nm。
一. 组织细胞裂解:
裂解前，组织或细胞用PBS洗涤2次去除甘油。
原代脂肪细胞裂解
200g 5分钟收集细胞。每100μl 压积 (packed cell volume, PCV)脂肪细胞加入1 ml裂解液，振荡裂解。
非脂肪细胞或分化的脂肪细胞
可消化、离心收集细胞，或直接在培养皿内裂解。通常6孔板单孔~2 x 106个细胞，75mm2瓶~1 x 107细胞。按比例每1x106细胞加0.1ml裂解液，混匀裂解。
动物组织裂解
离心管精确称重，加入组织块后再称重，二者相减(即减量称重法)精确计算组织重量(约50mg)。强烈建议按比例每1mg组织加20μl裂解液，可显著减少各样品间的蛋白和脂质含量变异；并强烈推荐裂解液用量在1ml左右，保证有效的匀浆裂解与脂质提取，这需要大约50mg组织。用电动高速匀浆分散器，或者手动玻璃匀浆器破碎组织。不推荐超声破碎组织细胞。
植物油料种子、食品、高浓度油样品的处理
减量称重法精确称重。推荐裂解液用量在1ml左右，保证有效的匀浆裂解与脂质提取。用研钵研磨样品。
二. 裂解液处理
1.
取500 μl裂解液转移到1.5ml离心管，进行下一步操作。余下的裂解液可使用BCA法蛋白定量试剂盒(#P1511)进行蛋白含量测定，或－20ºC储存。
2.
70ºC加热10分钟，组织量多时可能出现絮状沉淀。
3.
室温2000rpm离心5分钟，上层清液即可用于酶学测定。
三. 配制工作溶液：
按4:1比例，取4 ml试剂R1与1 ml试剂R2混合即可，立即使用或4ºC保存<1天，变色弃去。
四. 标准品稀释
4 mM甘油标准品用蒸馏水或与样本缓冲液一致的液体倍比稀释为1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625μM。注意设置0浓度对照反应管。测定油料种子、食品、高浓度油样品时可加2000μM标准管。
五. 甘油三酯测定
1.
参见下表加样测定标准品和样品。以96孔微板为例，待测样品体积可在5、10、20、30μl之间，推荐以10μl为起始加样量。如测量值超过线性范围可适当稀释，根据稀释倍数计算浓度。
2.
37ºC 10分钟，或25ºC室温20分钟。反应平衡后颜色在60分钟内稳定。
3.
先用蒸馏水空白管调零，然后测定各管OD值。
4.
绘制标准曲线并计算甘油三酯浓度。Excel作图步骤：各标准管OD值为y轴，标准品浓度为x轴。(1)鼠标左键圈住数据，点击-做图向导-，选择-散点图-，点击-完成-。(2)鼠标右键点图上的某一点，点击 -添加趋势线-，点击 -选项-，点击 -显示公式-和 -R2值-。
5.
以每mg蛋白浓度或细胞数校正甘油三酯含量。
表 加样比例 (线性范围20~2000 μmol/L)
|
96孔微板测定 |
1 ml比色杯测定 |
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空白管 |
标准品 |
样品 |
空白管 |
标准品 |
样品 |
|
蒸馏水μl |
10 |
|
|
35 |
|
|
|
标准品μl |
|
10 |
|
|
35 |
|
|
样品μl |
|
|
10 |
|
|
35 |
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工作液μl |
190 |
190 |
190 |
665 |
665 |
665 |
说明
1.
维生素C>0.18g/L、血红蛋白>2g/L、二硫苏糖醇、巯基乙醇、高浓度EDTA干扰测试。
2.
试剂混浊或550nm处空白反应管吸光度大于0.2时弃去。
3.
即使−20ºC储存甘油三酯也会水解，建议组织细胞－70 ºC不超过1月。
4.
不同类型的组织和细胞内甘油三酯含量差别很大，应根据预试验调整初始的组织细胞加入量。脂肪组织用量20~30mg/ml裂解液即可。
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